हा लेख तुम्हाला लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी कॉलम कसा निवडायचा हे शिकवतो

लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी ही प्रत्येक घटकाची सामग्री आणि कच्चा माल, इंटरमीडिएट्स, तयारी आणि पॅकेजिंग मटेरियलमधील अशुद्धता तपासण्यासाठी मुख्य पद्धत आहे, परंतु बर्याच पदार्थांवर अवलंबून राहण्यासाठी मानक पद्धती नाहीत, त्यामुळे नवीन पद्धती विकसित करणे अपरिहार्य आहे. लिक्विड फेज पद्धतींच्या विकासामध्ये, क्रोमॅटोग्राफिक कॉलम हा लिक्विड क्रोमॅटोग्राफीचा गाभा आहे, त्यामुळे योग्य क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ कसा निवडायचा हे महत्त्वपूर्ण आहे. या लेखात, लेखक तीन पैलूंमधून लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ कसा निवडायचा हे स्पष्ट करेल: एकूण कल्पना, विचार आणि अनुप्रयोग व्याप्ती.

A. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ निवडण्यासाठी एकूण कल्पना

1. विश्लेषकांच्या भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्मांचे मूल्यमापन करा: जसे की रासायनिक रचना, विद्राव्यता, स्थिरता (जसे की ते ऑक्सिडायझ्ड/कमी/हायड्रोलायझ्ड करणे सोपे आहे की नाही), आम्लता आणि क्षारता इ., विशेषतः रासायनिक रचना ही मुख्य गोष्ट आहे. गुणधर्म निर्धारित करणारे घटक, जसे की संयुग्मित गटामध्ये मजबूत अल्ट्राव्हायोलेट शोषण आणि मजबूत प्रतिदीप्ति असते;

2. विश्लेषणाचा उद्देश निश्चित करा: उच्च पृथक्करण, उच्च स्तंभ कार्यक्षमता, कमी विश्लेषण वेळ, उच्च संवेदनशीलता, उच्च दाब प्रतिरोध, दीर्घ स्तंभ जीवन, कमी खर्च इ. आवश्यक आहे का;

1. योग्य क्रोमॅटोग्राफिक कॉलम निवडा: क्रोमॅटोग्राफिक फिलरची रचना, भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्म समजून घ्या, जसे की कण आकार, छिद्र आकार, तापमान सहनशीलता, पीएच सहिष्णुता, विश्लेषकांचे शोषण इ.

1. लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ निवडण्यासाठी विचार

हा धडा क्रोमॅटोग्राफी स्तंभाच्या भौतिक आणि रासायनिक गुणधर्मांच्या दृष्टीकोनातून क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ निवडताना विचारात घेण्याच्या घटकांची चर्चा करेल. 2.1 फिलर मॅट्रिक्स

2.1.1 सिलिका जेल मॅट्रिक्स बहुतेक लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी स्तंभांचे फिलर मॅट्रिक्स सिलिका जेल असते. या प्रकारच्या फिलरमध्ये उच्च शुद्धता, कमी किंमत, उच्च यांत्रिक सामर्थ्य असते आणि गटांमध्ये बदल करणे सोपे असते (जसे की फिनाईल बाँडिंग, एमिनो बाँडिंग, सायनो बाँडिंग, इ.), परंतु पीएच मूल्य आणि तापमान श्रेणी ते सहन करते मर्यादित: बहुतेक सिलिका जेल मॅट्रिक्स फिलर्सची pH श्रेणी 2 ते 8 असते, परंतु विशेषत: सुधारित सिलिका जेल बाँड केलेल्या टप्प्यांची pH श्रेणी 1.5 ते 10 इतकी रुंद असू शकते, आणि विशेषत: सुधारित सिलिका जेल बाँड केलेले टप्पे देखील आहेत जे कमी pH वर स्थिर असतात, जसे की Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18, जे pH 1 ते 8 वर स्थिर आहे; सिलिका जेल मॅट्रिक्सची वरची तापमान मर्यादा सहसा 60 ℃ असते आणि काही क्रोमॅटोग्राफी स्तंभ उच्च pH वर 40 ℃ तापमान सहन करू शकतात.

2.1.2 पॉलिमर मॅट्रिक्स पॉलिमर फिलर बहुतेक पॉलिस्टीरिन-डिव्हिनिलबेन्झिन किंवा पॉलिमेथेक्रेलेट असतात. त्यांचे फायदे असे आहेत की ते विस्तृत पीएच श्रेणी सहन करू शकतात - ते 1 ते 14 च्या श्रेणीमध्ये वापरले जाऊ शकतात आणि ते उच्च तापमानास अधिक प्रतिरोधक आहेत (80 डिग्री सेल्सियसपेक्षा जास्त पोहोचू शकतात). सिलिका-आधारित C18 फिलर्सच्या तुलनेत, या प्रकारच्या फिलरमध्ये मजबूत हायड्रोफोबिसिटी असते आणि मॅक्रोपोरस पॉलिमर प्रथिने सारखे नमुने वेगळे करण्यात खूप प्रभावी आहे. त्याचे तोटे म्हणजे स्तंभाची कार्यक्षमता कमी आहे आणि यांत्रिक शक्ती सिलिका-आधारित फिलर्सपेक्षा कमकुवत आहे. 2.2 कण आकार

बहुतेक आधुनिक HPLC फिलर हे गोलाकार कण असतात, परंतु काहीवेळा ते अनियमित कण असतात. गोलाकार कण कमी स्तंभ दाब, उच्च स्तंभ कार्यक्षमता, स्थिरता आणि दीर्घ आयुष्य प्रदान करू शकतात; उच्च-स्निग्धता मोबाइल फेज (जसे की फॉस्फोरिक ऍसिड) वापरताना किंवा नमुना द्रावण चिकट असते तेव्हा, अनियमित कणांचे पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ मोठे असते, जे दोन टप्प्यांच्या पूर्ण क्रियेसाठी अधिक अनुकूल असते आणि किंमत तुलनेने कमी असते. 2.3 कण आकार

कणांचा आकार जितका लहान असेल तितका स्तंभ कार्यक्षमता जास्त आणि वेगळे करणे जितके जास्त असेल, परंतु उच्च दाब प्रतिरोधकता तितकी वाईट. सर्वात सामान्यपणे वापरलेला स्तंभ 5 μm कण आकाराचा स्तंभ आहे; पृथक्करण आवश्यकता जास्त असल्यास, 1.5-3 μm फिलर निवडले जाऊ शकते, जे काही जटिल मॅट्रिक्स आणि बहु-घटक नमुन्यांच्या पृथक्करण समस्येचे निराकरण करण्यासाठी अनुकूल आहे. UPLC 1.5 μm फिलर वापरू शकते; 10 μm किंवा मोठ्या कण आकाराचे फिलर बहुतेक वेळा अर्ध-तयारी किंवा पूर्वतयारी स्तंभांसाठी वापरले जातात. 2.4 कार्बन सामग्री

कार्बन सामग्री सिलिका जेलच्या पृष्ठभागावरील बॉन्डेड फेजचे प्रमाण दर्शवते, जे विशिष्ट पृष्ठभाग क्षेत्र आणि बाँड फेज कव्हरेजशी संबंधित आहे. उच्च कार्बन सामग्री उच्च स्तंभ क्षमता आणि उच्च रिझोल्यूशन प्रदान करते, आणि बर्याचदा जटिल नमुन्यांसाठी वापरला जातो ज्यांना उच्च पृथक्करण आवश्यक आहे, परंतु दोन टप्प्यांमधील दीर्घ परस्परसंवादाच्या वेळेमुळे, विश्लेषणाचा कालावधी मोठा आहे; कमी कार्बन सामग्री असलेल्या क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभांमध्ये विश्लेषणाचा कालावधी कमी असतो आणि ते भिन्न निवडकता दर्शवू शकतात आणि ते सहसा जलद विश्लेषणाची आवश्यकता असलेल्या साध्या नमुन्यांसाठी आणि उच्च जलीय अवस्था आवश्यक असलेल्या नमुन्यांसाठी वापरले जातात. साधारणपणे, C18 ची कार्बन सामग्री 7% ते 19% पर्यंत असते. 2.5 छिद्र आकार आणि विशिष्ट पृष्ठभाग क्षेत्र

HPLC शोषण माध्यम सच्छिद्र कण आहेत आणि बहुतेक संवाद छिद्रांमध्ये होतात. म्हणून, शोषण्यासाठी आणि विभक्त होण्यासाठी रेणूंनी छिद्रांमध्ये प्रवेश केला पाहिजे.

छिद्र आकार आणि विशिष्ट पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ या दोन पूरक संकल्पना आहेत. लहान छिद्र आकार म्हणजे मोठे विशिष्ट पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ आणि त्याउलट. मोठ्या विशिष्ट पृष्ठभागाच्या क्षेत्रामुळे नमुना रेणू आणि बाँड केलेल्या टप्प्यांमधील परस्परसंवाद वाढू शकतो, धारणा वाढवू शकतो, नमुना लोडिंग आणि स्तंभ क्षमता वाढवू शकतो आणि जटिल घटक वेगळे करू शकतो. पूर्णपणे सच्छिद्र फिलर्स या प्रकारच्या फिलरशी संबंधित असतात. उच्च पृथक्करण आवश्यकता असलेल्यांसाठी, मोठ्या विशिष्ट पृष्ठभागाच्या क्षेत्रासह फिलर निवडण्याची शिफारस केली जाते; लहान विशिष्ट पृष्ठभागाचे क्षेत्रफळ पाठीचा दाब कमी करू शकते, स्तंभाची कार्यक्षमता सुधारू शकते आणि समतोल वेळ कमी करू शकते, जे ग्रेडियंट विश्लेषणासाठी योग्य आहे. कोर-शेल फिलर्स या प्रकारच्या फिलरशी संबंधित आहेत. पृथक्करण सुनिश्चित करण्याच्या आधारावर, उच्च विश्लेषण कार्यक्षमतेची आवश्यकता असलेल्यांसाठी लहान विशिष्ट पृष्ठभागासह फिलर निवडण्याची शिफारस केली जाते. 2.6 छिद्र खंड आणि यांत्रिक शक्ती

पोर व्हॉल्यूम, ज्याला “पोअर व्हॉल्यूम” असेही म्हणतात, प्रति युनिट कण शून्य व्हॉल्यूमच्या आकाराचा संदर्भ देते. हे फिलरची यांत्रिक शक्ती चांगले प्रतिबिंबित करू शकते. मोठ्या छिद्रांचे प्रमाण असलेल्या फिलर्सची यांत्रिक ताकद लहान छिद्रे असलेल्या फिलर्सच्या तुलनेत थोडीशी कमकुवत असते. 1.5 mL/g पेक्षा कमी किंवा समान छिद्र असलेले फिलर्स बहुतेक HPLC वेगळे करण्यासाठी वापरले जातात, तर 1.5 mL/g पेक्षा जास्त छिद्र असलेले फिलर प्रामुख्याने आण्विक बहिष्कार क्रोमॅटोग्राफी आणि कमी-दाब क्रोमॅटोग्राफीसाठी वापरले जातात. 2.7 कॅपिंग दर

कॅपिंगमुळे संयुगे आणि उघड झालेल्या सिलॅनॉल गटांमधील परस्परसंवादामुळे होणारी शेपटी शिखरे कमी होऊ शकतात (जसे की अल्कधर्मी संयुगे आणि सिलॅनॉल गटांमधील आयनिक बाँडिंग, व्हॅन डेर वाल्स फोर्स आणि अम्लीय संयुगे आणि सिलनॉल गटांमधील हायड्रोजन बंध), ज्यामुळे स्तंभ कार्यक्षमता आणि शिखर आकार सुधारतो. . अनकॅप्ड बॉन्डेड टप्पे विशेषत: ध्रुवीय नमुन्यांसाठी, कॅप्ड बॉन्डेड टप्प्यांच्या तुलनेत भिन्न निवडकता निर्माण करतील.

1. विविध लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी कॉलम्सची ऍप्लिकेशन स्कोप

हा धडा काही प्रकरणांद्वारे विविध प्रकारच्या लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी स्तंभांच्या अनुप्रयोगाच्या व्याप्तीचे वर्णन करेल.

3.1 उलट-फेज C18 क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ

C18 स्तंभ हा सर्वात सामान्यपणे वापरला जाणारा उलट-फेज स्तंभ आहे, जो बहुतेक सेंद्रिय पदार्थांची सामग्री आणि अशुद्धता चाचणी पूर्ण करू शकतो आणि मध्यम-ध्रुवीय, कमकुवत ध्रुवीय आणि गैर-ध्रुवीय पदार्थांना लागू होतो. C18 क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभाचा प्रकार आणि तपशील विशिष्ट पृथक्करण आवश्यकतांनुसार निवडले जावे. उदाहरणार्थ, उच्च पृथक्करण आवश्यकता असलेल्या पदार्थांसाठी, 5 μm*4.6 mm*250 mm वैशिष्ट्यांचा वापर केला जातो; जटिल पृथक्करण मॅट्रिक्स आणि समान ध्रुवता असलेल्या पदार्थांसाठी, 4 μm*4.6 mm*250 mm तपशील किंवा लहान कण आकार वापरले जाऊ शकतात. उदाहरणार्थ, लेखकाने celecoxib API मध्ये दोन जीनोटॉक्सिक अशुद्धता शोधण्यासाठी 3 μm*4.6 mm*250 mm स्तंभ वापरला. दोन पदार्थांचे पृथक्करण 2.9 पर्यंत पोहोचू शकते, जे उत्कृष्ट आहे. याव्यतिरिक्त, वेगळे करणे सुनिश्चित करण्याच्या आधारावर, जलद विश्लेषण आवश्यक असल्यास, 10 मिमी किंवा 15 मिमीचा एक लहान स्तंभ अनेकदा निवडला जातो. उदाहरणार्थ, जेव्हा लेखकाने piperaquine फॉस्फेट API मध्ये जीनोटॉक्सिक अशुद्धता शोधण्यासाठी LC-MS/MS वापरला, तेव्हा 3 μm*2.1 mm*100 mm स्तंभ वापरला गेला. अशुद्धता आणि मुख्य घटक यांच्यातील पृथक्करण 2.0 होते आणि नमुना शोधणे 5 मिनिटांत पूर्ण केले जाऊ शकते. 3.2 उलट-फेज फिनाइल स्तंभ

फिनाइल कॉलम हा रिव्हर्स्ड-फेज कॉलमचा एक प्रकार आहे. या प्रकारच्या स्तंभामध्ये सुगंधी संयुगांसाठी मजबूत निवडकता असते. सामान्य C18 स्तंभाद्वारे मोजलेल्या सुगंधी संयुगांचा प्रतिसाद कमकुवत असल्यास, आपण फिनाइल स्तंभ बदलण्याचा विचार करू शकता. उदाहरणार्थ, जेव्हा मी celecoxib API बनवत होतो, त्याच निर्मात्याच्या फिनाइल कॉलम आणि त्याच स्पेसिफिकेशन (सर्व 5 μm*4.6 mm*250 mm) द्वारे मोजलेला मुख्य घटक प्रतिसाद C18 स्तंभाच्या 7 पट होता. 3.3 सामान्य-फेज स्तंभ

रिव्हर्स्ड-फेज कॉलमसाठी प्रभावी पूरक म्हणून, सामान्य-फेज कॉलम उच्च ध्रुवीय संयुगेसाठी योग्य आहे. रिव्हर्स्ड-फेज कॉलममध्ये 90% पेक्षा जास्त जलीय फेजसह एल्युट करताना शिखर अद्याप खूप वेगवान असल्यास, आणि सॉल्व्हेंट शिखराच्या अगदी जवळ आणि ओव्हरलॅप होत असल्यास, आपण सामान्य-फेज स्तंभ बदलण्याचा विचार करू शकता. या प्रकारच्या कॉलममध्ये हिलिक कॉलम, एमिनो कॉलम, सायनो कॉलम इ.

3.3.1 हिलिक कॉलम हिलिक कॉलम ध्रुवीय पदार्थांना प्रतिसाद वाढवण्यासाठी बॉन्डेड अल्काइल साखळीमध्ये हायड्रोफिलिक गटांना एम्बेड करतो. या प्रकारचा स्तंभ साखर पदार्थांच्या विश्लेषणासाठी योग्य आहे. xylose आणि त्याच्या डेरिव्हेटिव्ह्जची सामग्री आणि संबंधित पदार्थ करताना लेखकाने या प्रकारच्या स्तंभाचा वापर केला आहे. xylose डेरिव्हेटिव्हचे isomers देखील चांगले वेगळे केले जाऊ शकतात;

3.3.2 अमिनो कॉलम आणि सायनो कॉलम एमिनो कॉलम आणि सायनो कॉलम बॉन्डेड अल्काइल साखळीच्या शेवटी अमिनो आणि सायनो बदलांच्या परिचयाचा संदर्भ देतात, विशेष पदार्थांसाठी निवडकता सुधारण्यासाठी: उदाहरणार्थ, अमिनो कॉलम ही एक चांगली निवड आहे. शर्करा, एमिनो ऍसिडस्, बेस आणि एमाइड्स वेगळे करण्यासाठी; संयुग्मित बाँड्सच्या उपस्थितीमुळे हायड्रोजनेटेड आणि हायड्रोजन न केलेले स्ट्रक्चरल समान पदार्थ वेगळे करताना सायनो कॉलमची निवड चांगली असते. एमिनो कॉलम आणि सायनो कॉलम सहसा सामान्य फेज कॉलम आणि रिव्हर्स फेज कॉलम दरम्यान स्विच केले जाऊ शकतात, परंतु वारंवार स्विच करण्याची शिफारस केलेली नाही. 3.4 चिरल स्तंभ

चिरल स्तंभ, नावाप्रमाणेच, चिरल संयुगे वेगळे करण्यासाठी आणि विश्लेषणासाठी, विशेषतः फार्मास्युटिकल्सच्या क्षेत्रात योग्य आहे. जेव्हा पारंपारिक रिव्हर्स फेज आणि सामान्य फेज कॉलम आयसोमर्सचे पृथक्करण साध्य करू शकत नाहीत तेव्हा या प्रकारच्या स्तंभाचा विचार केला जाऊ शकतो. उदाहरणार्थ, लेखकाने 1,2-डिफेनिलेथिलेनेडायमिनचे दोन आयसोमर वेगळे करण्यासाठी 5 μm*4.6 mm*250 mm चिरल कॉलम वापरला: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine आणि (1R, 2R)-1, 2 -डिफेनिलेथिलेनेडायमिन, आणि दोघांमधील विभक्तता सुमारे 2.0 पर्यंत पोहोचली. तथापि, चिरल स्तंभ इतर प्रकारच्या स्तंभांपेक्षा अधिक महाग असतात, सामान्यतः 1W+/piece. अशा स्तंभांची आवश्यकता असल्यास, युनिटला पुरेसे बजेट तयार करणे आवश्यक आहे. 3.5 आयन एक्सचेंज कॉलम

आयन एक्सचेंज कॉलम चार्ज केलेले आयन, जसे की आयन, प्रथिने, न्यूक्लिक ॲसिड आणि काही साखरेचे पदार्थ वेगळे करण्यासाठी आणि विश्लेषणासाठी योग्य आहेत. फिलर प्रकारानुसार, ते कॅशन एक्सचेंज कॉलम्स, ॲनिअन एक्सचेंज कॉलम्स आणि मजबूत कॅशन एक्सचेंज कॉलम्समध्ये विभागलेले आहेत.

कॅशन एक्सचेंज कॉलम्समध्ये कॅल्शियम-आधारित आणि हायड्रोजन-आधारित स्तंभांचा समावेश होतो, जे प्रामुख्याने अमीनो ऍसिडसारख्या कॅशनिक पदार्थांच्या विश्लेषणासाठी योग्य असतात. उदाहरणार्थ, फ्लशिंग सोल्यूशनमध्ये कॅल्शियम ग्लुकोनेट आणि कॅल्शियम एसीटेटचे विश्लेषण करताना लेखकाने कॅल्शियम-आधारित स्तंभ वापरले आहेत. दोन्ही पदार्थांना λ=210nm वर जोरदार प्रतिसाद मिळाला आणि पृथक्करण पदवी 3.0 पर्यंत पोहोचली; ग्लुकोज-संबंधित पदार्थांचे विश्लेषण करताना लेखकाने हायड्रोजन-आधारित स्तंभ वापरले. अनेक प्रमुख संबंधित पदार्थ - माल्टोज, माल्टोट्रिओज आणि फ्रक्टोज - डिफरेंशियल डिटेक्टर अंतर्गत उच्च संवेदनशीलता होते, ज्याची ओळख मर्यादा 0.5 पीपीएम इतकी कमी आणि 2.0-2.5 पृथक्करण डिग्री असते.

आयन एक्सचेंज कॉलम प्रामुख्याने सेंद्रिय ऍसिड आणि हॅलोजन आयन यांसारख्या ॲनिओनिक पदार्थांच्या विश्लेषणासाठी योग्य आहेत; मजबूत केशन एक्सचेंज कॉलममध्ये आयन एक्सचेंज क्षमता आणि निवडकता जास्त असते आणि ते जटिल नमुन्यांच्या पृथक्करण आणि विश्लेषणासाठी योग्य असतात.

वरील काही सामान्य लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी कॉलम्सचे प्रकार आणि ॲप्लिकेशन रेंजची केवळ एक ओळख आहे आणि लेखकाच्या स्वतःच्या अनुभवासह एकत्रित केले आहे. वास्तविक ऍप्लिकेशन्समध्ये इतर विशेष प्रकारचे क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ आहेत, जसे की मोठ्या-छिद्र क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ, लहान-छिद्र क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ, ॲफिनिटी क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ, मल्टीमोड क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभ, अल्ट्रा-हाय परफॉर्मन्स लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी (उच्च कार्यक्षमता लिक्विड क्रोमॅटोग्राफी) SFC), इत्यादी विविध क्षेत्रांत महत्त्वाची भूमिका बजावतात. विशिष्ट प्रकारच्या क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभाची रचना आणि गुणधर्म, पृथक्करण आवश्यकता आणि इतर हेतूंनुसार निवड केली पाहिजे.