मायक्रोबियल मेटाप्रोटिओमिक्स: नमुना प्रक्रिया, डेटा संकलन ते डेटा विश्लेषण

वू एनहुई, किआओ लियांग*

रसायनशास्त्र विभाग, फुदान विद्यापीठ, शांघाय 200433, चीन

सूक्ष्मजीव मानवी रोग आणि आरोग्याशी जवळून संबंधित आहेत. सूक्ष्मजीव समुदायांची रचना आणि त्यांची कार्ये कशी समजून घ्यावी हा एक प्रमुख मुद्दा आहे ज्याचा तातडीने अभ्यास करणे आवश्यक आहे. अलिकडच्या वर्षांत, सूक्ष्मजीवांच्या रचना आणि कार्याचा अभ्यास करण्यासाठी मेटाप्रोटिओमिक्स हे एक महत्त्वाचे तांत्रिक माध्यम बनले आहे. तथापि, सूक्ष्मजीव सामुदायिक नमुन्यांची जटिलता आणि उच्च विषमतेमुळे, नमुना प्रक्रिया, मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संपादन आणि डेटा विश्लेषण ही सध्या मेटाप्रोटिओमिक्ससमोरील तीन प्रमुख आव्हाने बनली आहेत. मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषणामध्ये, विविध प्रकारच्या नमुन्यांची प्रीट्रीटमेंट ऑप्टिमाइझ करणे आणि विविध सूक्ष्मजीव वेगळे करणे, संवर्धन, निष्कर्षण आणि लिसिस योजनांचा अवलंब करणे आवश्यक असते. एकाच प्रजातीच्या प्रोटीओम प्रमाणेच, मेटाप्रोटिओमिक्समधील मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एक्विझिशन मोडमध्ये डेटा-डिपेंडेंट एक्विझिशन (DDA) मोड आणि डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (DIA) मोडचा समावेश होतो. डीआयए डेटा संपादन मोड नमुन्याची पेप्टाइड माहिती पूर्णपणे संकलित करू शकतो आणि त्यात मोठी विकास क्षमता आहे. तथापि, मेटाप्रोटीओम नमुन्यांच्या जटिलतेमुळे, त्याचे डीआयए डेटा विश्लेषण ही एक मोठी समस्या बनली आहे जी मेटाप्रोटिओमिक्सच्या खोल कव्हरेजमध्ये अडथळा आणते. डेटा विश्लेषणाच्या दृष्टीने, सर्वात महत्वाची पायरी म्हणजे प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस तयार करणे. डेटाबेसचा आकार आणि पूर्णता केवळ ओळखीच्या संख्येवरच प्रभाव पाडत नाही तर प्रजाती आणि कार्यात्मक स्तरावरील विश्लेषणावर देखील परिणाम करते. सध्या, मेटाप्रोटीओम डेटाबेसच्या बांधकामासाठी सुवर्ण मानक हे मेटाजेनोमवर आधारित प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस आहे. त्याच वेळी, पुनरावृत्ती शोधावर आधारित सार्वजनिक डेटाबेस फिल्टरिंग पद्धत देखील मजबूत व्यावहारिक मूल्य असल्याचे सिद्ध झाले आहे. विशिष्ट डेटा विश्लेषण धोरणांच्या दृष्टीकोनातून, पेप्टाइड-केंद्रित DIA डेटा विश्लेषण पद्धतींनी परिपूर्ण मुख्य प्रवाह व्यापला आहे. सखोल शिक्षण आणि कृत्रिम बुद्धिमत्तेच्या विकासासह, ते मॅक्रोप्रोटिओमिक डेटा विश्लेषणाची अचूकता, कव्हरेज आणि विश्लेषण गतीला मोठ्या प्रमाणात प्रोत्साहन देईल. डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉरमॅटिक्स विश्लेषणाच्या दृष्टीने, अलिकडच्या वर्षांत भाष्य साधनांची मालिका विकसित केली गेली आहे, जी सूक्ष्मजीव समुदायांची रचना प्राप्त करण्यासाठी प्रोटीन स्तर, पेप्टाइड स्तर आणि जनुक स्तरावर प्रजाती भाष्य करू शकतात. इतर ओमिक्स पद्धतींच्या तुलनेत, सूक्ष्मजीव समुदायांचे कार्यात्मक विश्लेषण हे मॅक्रोप्रोटिओमिक्सचे एक अद्वितीय वैशिष्ट्य आहे. मायक्रोबियल समुदायांच्या मल्टी-ओमिक्स विश्लेषणाचा मॅक्रोप्रोटिओमिक्स हा एक महत्त्वाचा भाग बनला आहे आणि तरीही कव्हरेज खोली, शोध संवेदनशीलता आणि डेटा विश्लेषण पूर्णतेच्या बाबतीत खूप विकास क्षमता आहे.

01 नमुना पूर्व उपचार

सध्या, मानवी सूक्ष्मजीव, माती, अन्न, महासागर, सक्रिय गाळ आणि इतर क्षेत्रांच्या संशोधनात मेटाप्रोटिओमिक्स तंत्रज्ञानाचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जात आहे. एकाच प्रजातीच्या प्रोटीओम विश्लेषणाशी तुलना करता, जटिल नमुन्यांच्या मेटाप्रोटीओमच्या नमुना प्रीट्रीटमेंटला अधिक आव्हानांचा सामना करावा लागतो. वास्तविक नमुन्यांमधील सूक्ष्मजीव रचना जटिल आहे, विपुलतेची गतिशील श्रेणी मोठी आहे, विविध प्रकारच्या सूक्ष्मजीवांच्या सेल भिंतीची रचना खूप वेगळी आहे आणि नमुन्यांमध्ये बहुतेक वेळा यजमान प्रथिने आणि इतर अशुद्धता मोठ्या प्रमाणात असतात. म्हणून, मेटाप्रोटीओमच्या विश्लेषणामध्ये, विविध प्रकारचे नमुने ऑप्टिमाइझ करणे आणि विविध सूक्ष्मजीव वेगळे करणे, संवर्धन, निष्कर्षण आणि लिसिस योजनांचा अवलंब करणे आवश्यक असते.

वेगवेगळ्या नमुन्यांमधून मायक्रोबियल मेटाप्रोटीओम्स काढण्यात काही समानता तसेच काही फरक आहेत, परंतु सध्या विविध प्रकारच्या मेटाप्रोटीओम नमुन्यांसाठी एकत्रित पूर्व-प्रक्रिया प्रक्रियेचा अभाव आहे.

02मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संपादन

शॉटगन प्रोटीओम विश्लेषणामध्ये, प्रीट्रीटमेंटनंतर पेप्टाइड मिश्रण प्रथम क्रोमॅटोग्राफिक स्तंभात वेगळे केले जाते आणि नंतर आयनीकरणानंतर डेटा संपादनासाठी मास स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये प्रवेश करते. एकल प्रजातीच्या प्रोटीओम विश्लेषणाप्रमाणेच, मॅक्रोप्रोटीओम विश्लेषणातील मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संपादन मोडमध्ये डीडीए मोड आणि डीआयए मोडचा समावेश होतो.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री साधनांच्या सतत पुनरावृत्ती आणि अद्यतनासह, उच्च संवेदनशीलता आणि रिझोल्यूशनसह मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणे मेटाप्रोटीओमवर लागू केली जातात आणि मेटाप्रोटीओम विश्लेषणाची कव्हरेज खोली देखील सतत सुधारली जाते. बऱ्याच काळापासून, ऑर्बिट्रॅपच्या नेतृत्वाखालील उच्च-रिझोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणांची मालिका मेटाप्रोटीओममध्ये मोठ्या प्रमाणात वापरली जात आहे.

मूळ मजकुराची तक्ता 1 मेटाप्रोटिओमिक्स वरील काही प्रातिनिधिक अभ्यास दर्शविते 2011 पासून आत्तापर्यंत नमुना प्रकार, विश्लेषण धोरण, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इन्स्ट्रुमेंट, संपादन पद्धत, विश्लेषण सॉफ्टवेअर आणि ओळख संख्या.

03 मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा विश्लेषण

3.1 DDA डेटा विश्लेषण धोरण

3.1.1 डेटाबेस शोध

३.१.२de novoअनुक्रम धोरण

3.2 DIA डेटा विश्लेषण धोरण

04 प्रजाती वर्गीकरण आणि कार्यात्मक भाष्य

विविध वर्गीकरण स्तरांवर सूक्ष्मजीव समुदायांची रचना मायक्रोबायोम संशोधनातील प्रमुख संशोधन क्षेत्रांपैकी एक आहे. अलिकडच्या वर्षांत, सूक्ष्मजीव समुदायांची रचना प्राप्त करण्यासाठी प्रथिने स्तर, पेप्टाइड स्तर आणि जनुक स्तरावर प्रजातींचे भाष्य करण्यासाठी भाष्य साधनांची मालिका विकसित केली गेली आहे.

फंक्शनल एनोटेशनचे सार म्हणजे लक्ष्य प्रोटीन अनुक्रमाची फंक्शनल प्रोटीन सीक्वेन्स डेटाबेसशी तुलना करणे. जीओ, सीओजी, केईजीजी, एगएनओजी, इत्यादी सारख्या जनुक कार्य डेटाबेसचा वापर करून, मॅक्रोप्रोटीओम्सद्वारे ओळखल्या जाणाऱ्या प्रथिनांवर भिन्न कार्यात्मक भाष्य विश्लेषण केले जाऊ शकते. भाष्य साधनांमध्ये Blast2GO, DAVID, KOBAS, इ.

05 सारांश आणि आउटलुक

मानवी आरोग्य आणि रोगामध्ये सूक्ष्मजीव महत्त्वपूर्ण भूमिका बजावतात. अलिकडच्या वर्षांत, सूक्ष्मजीव समुदायांच्या कार्याचा अभ्यास करण्यासाठी मेटाप्रोटिओमिक्स हे एक महत्त्वाचे तांत्रिक माध्यम बनले आहे. मेटाप्रोटिओमिक्सची विश्लेषणात्मक प्रक्रिया एकल-प्रजाती प्रोटिओमिक्ससारखीच आहे, परंतु मेटाप्रोटिओमिक्सच्या संशोधन ऑब्जेक्टच्या जटिलतेमुळे, नमुना प्रीट्रीटमेंट, डेटा संपादन ते डेटा विश्लेषणापर्यंत प्रत्येक विश्लेषण चरणात विशिष्ट संशोधन धोरणे स्वीकारणे आवश्यक आहे. सध्या, प्रीट्रीटमेंट पद्धतींच्या सुधारणेमुळे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री तंत्रज्ञानातील सतत नवनवीन शोध आणि बायोइन्फॉरमॅटिक्सच्या जलद विकासामुळे, मेटाप्रोटिओमिक्सने ओळख खोली आणि अनुप्रयोगाच्या व्याप्तीमध्ये मोठी प्रगती केली आहे.

मॅक्रोप्रोटीओम नमुन्यांच्या पूर्व-उपचार प्रक्रियेत, नमुन्याचे स्वरूप प्रथम विचारात घेतले पाहिजे. पर्यावरणीय पेशी आणि प्रथिनांपासून सूक्ष्मजीव वेगळे कसे करावे हे मॅक्रोप्रोटीओम्ससमोरील प्रमुख आव्हानांपैकी एक आहे आणि पृथक्करण कार्यक्षमता आणि सूक्ष्मजीवांचे नुकसान यांच्यातील संतुलन ही तातडीची समस्या आहे. दुसरे म्हणजे, सूक्ष्मजीवांचे प्रथिने काढताना वेगवेगळ्या जीवाणूंच्या संरचनात्मक विषमतेमुळे होणारे फरक लक्षात घेतले पाहिजेत. ट्रेस श्रेणीतील मॅक्रोप्रोटीओम नमुन्यांना विशिष्ट पूर्व-उपचार पद्धती देखील आवश्यक असतात.

मास स्पेक्ट्रोमेट्री साधनांच्या संदर्भात, मुख्य प्रवाहातील मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणांमध्ये ऑर्बिट्रॅप मास विश्लेषकांवर आधारित मास स्पेक्ट्रोमीटरपासून संक्रमण झाले आहे जसे की LTQ-Orbitrap आणि Q Exactive वर आधारित वस्तुमान स्पेक्ट्रोमीटरमध्ये आयन मोबिलिटी जोडलेले टाइम-ऑफ-फ्लाइट मास विश्लेषक जसे की timsTOF Pro. . आयन गतिशीलता परिमाण माहिती असलेल्या साधनांच्या timsTOF मालिकेत उच्च शोध अचूकता, कमी शोध मर्यादा आणि चांगली पुनरावृत्तीक्षमता आहे. ते हळूहळू विविध संशोधन क्षेत्रांमध्ये महत्त्वाचे साधन बनले आहेत ज्यांना मास स्पेक्ट्रोमेट्री शोधणे आवश्यक आहे, जसे की प्रोटीओम, मेटाप्रोटीओम आणि एकाच प्रजातीचे मेटाबोलोम. हे लक्षात घेण्यासारखे आहे की बर्याच काळापासून, मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणांच्या डायनॅमिक श्रेणीने मेटाप्रोटीओम संशोधनाच्या प्रथिने कव्हरेजची खोली मर्यादित केली आहे. भविष्यात, मोठ्या डायनॅमिक श्रेणीसह मास स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरणे मेटाप्रोटीओम्समध्ये प्रथिने ओळखण्याची संवेदनशीलता आणि अचूकता सुधारू शकतात.

वस्तुमान स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा संपादनासाठी, जरी एकाच प्रजातीच्या प्रोटीओममध्ये DIA डेटा संपादन मोड मोठ्या प्रमाणावर स्वीकारला गेला असला तरी, बहुतेक वर्तमान मॅक्रोप्रोटीओम विश्लेषणे अद्याप DDA डेटा संपादन मोड वापरतात. DIA डेटा संपादन मोड नमुन्याची फ्रॅगमेंट आयन माहिती पूर्णपणे प्राप्त करू शकतो आणि DDA डेटा संपादन मोडच्या तुलनेत, त्यात मॅक्रोप्रोटीओम नमुन्याची पेप्टाइड माहिती पूर्णपणे प्राप्त करण्याची क्षमता आहे. तथापि, DIA डेटाच्या उच्च जटिलतेमुळे, DIA मॅक्रोप्रोटीओम डेटाचे विश्लेषण अद्याप मोठ्या अडचणींना तोंड देत आहे. कृत्रिम बुद्धिमत्ता आणि सखोल शिक्षणाच्या विकासामुळे DIA डेटा विश्लेषणाची अचूकता आणि पूर्णता सुधारणे अपेक्षित आहे.

मेटाप्रोटिओमिक्सच्या डेटा विश्लेषणामध्ये, मुख्य टप्प्यांपैकी एक म्हणजे प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस तयार करणे. आतड्यांसंबंधी फ्लोरा सारख्या लोकप्रिय संशोधन क्षेत्रासाठी, IGC आणि HMP सारख्या आतड्यांसंबंधी सूक्ष्मजीव डेटाबेस वापरला जाऊ शकतो, आणि चांगले ओळख परिणाम प्राप्त झाले आहेत. इतर बहुतेक मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषणासाठी, सर्वात प्रभावी डेटाबेस बांधकाम धोरण म्हणजे मेटाजेनोमिक सिक्वेन्सिंग डेटावर आधारित नमुना-विशिष्ट प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस स्थापित करणे. उच्च जटिलता आणि मोठ्या डायनॅमिक श्रेणीसह सूक्ष्मजीव समुदाय नमुन्यांसाठी, कमी-विपुल प्रजातींची ओळख वाढवण्यासाठी अनुक्रम खोली वाढवणे आवश्यक आहे, ज्यामुळे प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेसचे कव्हरेज सुधारते. जेव्हा अनुक्रम डेटाची कमतरता असते, तेव्हा सार्वजनिक डेटाबेस ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी पुनरावृत्ती शोध पद्धत वापरली जाऊ शकते. तथापि, पुनरावृत्ती शोध FDR गुणवत्ता नियंत्रणावर परिणाम करू शकतो, म्हणून शोध परिणाम काळजीपूर्वक तपासणे आवश्यक आहे. याव्यतिरिक्त, मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषणामध्ये पारंपारिक FDR गुणवत्ता नियंत्रण मॉडेल्सची उपयुक्तता अद्याप शोधण्यासारखी आहे. शोध धोरणाच्या दृष्टीने, हायब्रिड स्पेक्ट्रल लायब्ररी धोरण DIA मेटाप्रोटिओमिक्सच्या कव्हरेजची खोली सुधारू शकते. अलिकडच्या वर्षांत, सखोल शिक्षणाच्या आधारे व्युत्पन्न केलेल्या अंदाजित वर्णक्रमीय लायब्ररीने DIA प्रोटीओमिक्समध्ये उत्कृष्ट कामगिरी दर्शविली आहे. तथापि, मेटाप्रोटीओम डेटाबेसमध्ये अनेकदा लाखो प्रथिने नोंदी असतात, ज्याचा परिणाम मोठ्या प्रमाणात अंदाजित स्पेक्ट्रल लायब्ररीमध्ये होतो, भरपूर संगणन संसाधने वापरतात आणि मोठ्या शोध जागेवर परिणाम होतो. याव्यतिरिक्त, मेटाप्रोटीओम्समधील प्रथिने अनुक्रमांमधील समानता मोठ्या प्रमाणात बदलते, ज्यामुळे स्पेक्ट्रल लायब्ररी अंदाज मॉडेलची अचूकता सुनिश्चित करणे कठीण होते, त्यामुळे मेटाप्रोटीओमिक्समध्ये अंदाजित वर्णपट ग्रंथालयांचा मोठ्या प्रमाणावर वापर केला जात नाही. याव्यतिरिक्त, उच्च अनुक्रम-समान प्रथिनांच्या मेटाप्रोटिओमिक्स विश्लेषणास लागू करण्यासाठी नवीन प्रोटीन अनुमान आणि वर्गीकरण भाष्य धोरण विकसित करणे आवश्यक आहे.

सारांश, एक उदयोन्मुख मायक्रोबायोम संशोधन तंत्रज्ञान म्हणून, मेटाप्रोटिओमिक्स तंत्रज्ञानाने महत्त्वपूर्ण संशोधन परिणाम प्राप्त केले आहेत आणि मोठ्या विकासाची क्षमता देखील आहे.